Uuden molekulaarisen menetelmän soveltaminen syöpädiagnostiikkaan : AR-V7 mRNA:n detektio

Huolimatta viimeaikaisista edistysaskelista syöpädiagnostiikan ja syöpähoitojen saralla, on tämä kompleksi ja monitahoinen tauti yhä yksi maailman yleisimmistä kuolinsyistä. Uusia ja nopeita diagnostisia menetelmiä tarvitaan syöpätautien tunnistamiseen niiden aikaisessa kehitysvaiheessa, jotta tautien aiempi prognoosi, parempi riskienhallinta ja tehokkaampi hoito olisivat mahdollisia. Kiinnostus spesifisiin molekulaarisiin biomerkkiaineisiin, jotka toimivat syövän tunnusmerkkeinä, on vähitellen kasvamassa. Näiden merkkiaineiden tunnistaminen nestemäisistä näytemateriaaleista kehittyneiden molekulaaristen diagnostiikkamenetelmien avulla tarjoaa huomattavia etuja perinteisiin onkologiassa käytettäviin kuvantamismenetelmiin verrattuna. Tämän tutkielman tavoite oli tutkia uuden molekulaarisen menetelmän, SIBA®:n (Strand Invasion Based Amplification), soveltuvuutta syöpämerkkiaineiden tunnistamiseen, sekä kehittää testi androgeenireseptorin silmukointivariantti 7 (AR-V7) mRNA:n tunnistamiseen. AR-V7:ä on esitetty hoitovaste-biomerkkiaineeksi potilaissa, joilla on metastaattinen kastraatioresistentti eturauhassyöpä (mCRPC). Tämän variantin ekspressio voi ilmaista kehittynyttä resistenssiä edistyneen eturauhassyövän hoitoon käytetyille hormonaalisille hoidoille. Eturauhassyöpä on maailmanlaajuisesti toiseksi yleisin miehillä esiintyvä syöpä keuhkosyövän jälkeen, ja se voi vähitellen kehittyä pitkälle edenneeksi kuolettavaksi metastaattiseksi kastraatioresistentiksi eturauhassyöväksi, johon androgeeni-deprivaatiohoito ei enää toimi. Positiivisen AR-V7-statuksen on esitetty edustavan tämän pitkälle edenneen eturauhassyövän fenotyyppiä, ja sen tunnistaminen voi auttaa sopivan hoitomuodon valinnassa mCRPC-potilaille. SIBA on uusi isotermaalinen menetelmä nukleiinihappojen monistamiseen ja tunnistamiseen. Teknologia tarjoaa merkittäviä etuja perinteiseen molekulaariseen tunnistusmenetelmään, polymeraasiketjureaktioon (PCR) verrattuna, sillä SIBA-monistus tapahtuu vakiolämpötilassa eikä vaadi lämpösykliseen monistamiseen tarvittavaa hienostunutta laboratoriovälineistöä. Käänteistranskriptio-SIBA (RT-SIBA) mahdollistaa RNA:n käänteistranskription cDNA:ksi samanaikaisesti cDNA:n monistuksen ja tunnistuksen kanssa yksivaiheisessa reaktiossa ja isotermaalisissa olosuhteissa. Menetelmä on osoittanut korkeaa analyyttistä herkkyyttä sekä spesifisyyttä kohdenukleiinihapoille. RT-SIBA-teknologiaa ei ole aiemmin sovellettu ihmisperäisen DNA:n tai RNA:n tunnistamiseen. Tämän tutkielman tärkein havainto oli, että RT-SIBA-teknologiaa voidaan soveltaa molekulaaristen syöpämerkkiaineiden, kuten AR-V7 mRNA:n, nopeaan ja spesifiseen tunnistamiseen. Tässä tutkimuksessa kehitettiin ja optimoitiin kaksi RT-SIBA-testiä, jotka kohdistuivat täyspitkän androgeenireseptori (AR-FL) mRNA:n sekä androgeenireseptorin silmukointivariantti 7 (AR-V7) mRNA:n tunnistamiseen. Näiden testien suorituskykyä arvioitiin testaamalla RNA:ta, joka oli eristetty AR-V7 positiivisista sekä negatiivisista eturauhassyöpäsoluista. Reaktiossa oli samanaikaisesti läsnä myös nestemäistä näytemateriaalia; kokoverta tai plasmaa. Kehitetyt RT-SIBA-testit olivat analyyttisesti erittäin spesifisiä ja herkkiä: ne monistivat alhaisia kopiomääriä kohde-mRNA:ta alle 20 minuutissa ilman epäspesifisten amplikonien muodostumista. Tulokset osoittavat, että RT-SIBA-teknologiaa voidaan hyödyntää AR-V7 ja AR-FL mRNA:n helppoon ja nopeaan tunnistukseen suoraan nestemäisestä näytemateriaalista ilman aikaa vievää näytteenkäsittelyä. Jatkokokeet todellisilla AR-V7-positiivisilla mCRPC-potilaiden kliinisillä näytteillä ovat tarpeellisia, jotta kehitetyt testit voidaan validoida luotettavasti.Despite recent advances in understanding, diagnosis and treatment of cancer, this complex and versatile disease remains one of the leading causes of death worldwide. New and rapid diagnostic methods are needed to detect cancers at their early stages of development, thus enabling earlier prognosis, better risk assessment and more efficient treatment of the disease. There has been an increasing interest in specific molecular biomarkers as the hallmark for cancer research, and the detection of these markers from liquid biopsies using advanced molecular diagnostics methods provides major advantages over the conventional imaging methods currently used in oncology. The aims of this thesis were to examine the applicability of a novel molecular method, SIBA® (Strand Invasion Based Amplification), for the detection of cancer biomarkers, and to develop an assay targeting androgen receptor splice variant 7 (AR-V7) mRNA. The AR-V7 is proposed as a treatment-response biomarker in patients with castration-resistant metastatic prostate cancer (mCRPC). The expression of this variant can indicate resistance to hormonal therapies used for the treatment of advanced prostate cancer. Prostate cancer is the most common cancer after lung cancer in men worldwide and can gradually develop into a highly advanced lethal form, mCRPC, that is not responsive to androgen deprivation therapies. Positive AR-V7 status is suggested to represent the phenotype of this advanced stage of prostate cancer, and its detection can assist in treatment selection for the mCRPC patients. SIBA is a novel isothermal method for the amplification and detection of nucleic acids. The technology offers significant advantages over the more conventional molecular detection method, polymerase chain reaction (PCR), since the amplification reaction occurs at constant temperature and does not require sophisticated laboratory equipment for the thermal cycling. Reverse transcription SIBA (RT-SIBA) enables reverse transcription of RNA to cDNA as well as the simultaneous amplification and detection of the cDNA in one-step reaction under isothermal conditions. The method displays both high analytical sensitivity and specificity to the target nucleic acids. The RT-SIBA technology has not formerly been applied for the detection of human DNA or RNA. The main finding of this thesis was, that the RT-SIBA technology can be applied for rapid detection of specific molecular cancer biomarkers such as the AR-V7 mRNA. In this study, two RT-SIBA assays targeting the full-length androgen receptor (AR-FL) mRNA and the AR splice variant 7 mRNA were developed and optimized. Performance of the assays were evaluated by testing RNA isolates from AR-V7 positive and negative prostate cancer cell lines in the presence of human whole blood and plasma in the reaction. The developed RT-SIBA assays provided high analytical sensitivity and specificity: low copies of the target mRNA were amplified within 20 minutes without the production of non-intended amplicons. The results suggest that the RT-SIBA technology can be utilized for easy and rapid detection of AR-V7 and AR-FL mRNA directly from liquid sample material without a need for time-consuming sample treatment. Further performance evaluation using real AR-V7 positive clinical samples from mCRPC patients is necessary for the reliable validation of the developed assays

Development and evaluation of a rapid nucleic acid amplification method to detect influenza A and B viruses in human respiratory specimens

Isothermal nucleic acid amplification methods can potentially shorten the amount of time required to diagnose influenza. We developed and evaluated a novel isothermal nucleic acid amplification method, RT-SIBA to rapidly detect and differentiate between influenza A and B viruses in a single reaction tube. The performance of the RT-SIBA Influenza assay was compared with two established RT-PCR methods. The sensitivities of the RT-SIBA, RealStar RT-PCR, and CDC RT-PCR assays for the detection of influenza A and B viruses in the clinical specimens were 98.8%, 100%, and 89.3%, respectively. All three assays demonstrated a specificity of 100%. The average time to positive result was significantly shorter with the RT-SIBA Influenza assay (90 min). The method can be run using battery-operated, portable devices with a small footprint and therefore has potential applications in both laboratory and near-patient settings. (C) 2018 Elsevier Inc. All rights reserved.Peer reviewe

Detection of human rhinoviruses by reverse transcription strand invasion based amplification method (RT-SIBA)

Background: Rhinovirus (RV), a major cause of respiratory infection in humans, imposes an enormous economic burden due to the direct and indirect costs associated with the illness. Accurate and timely diagnosis is crucial for deciding the appropriate clinical approach and minimizing unnecessary prescription of antibiotics. Diagnosis of RV is extremely challenging due to genetic and serological variability among its numerous types and their similarity to enteroviruses. Objective: We sought to develop a rapid nucleic acid test that can be used for the detection of Rhinovirus within both laboratory and near patient settings. Study design: We developed and evaluated a novel isothermal nucleic acid amplification method called Reverse Transcription Strand Invasion-Based Amplification (RT-SIBA) to rapidly detect Rhinovirus from clinical specimens. Result: The method, RT-SIBA, detected RV in clinical specimens with high analytical sensitivity (96%) and specificity (100%). The time to positive result was significantly shorter for the RV RT-SIBA assay than for a reference RV nucleic acid amplification method (RT-qPCR). Conclusion: The rapid detection time of the RV SIBA assay, as well as its compatibility with portable instruments, will facilitate prompt diagnosis of infection and thereby improve patient care.Peer reviewe

Uuden nukleiinihappoeristykseen pohjautuvan näytteenkäsittelymenetelmän kehittäminen rinovirukselle

Rinovirukset ovat yleisimpiä ympärivuotisia lievien hengitystieinfektioiden aiheuttajia. Rinovirusten aiheuttamiin hengitystiesairauksiin liittyvät lääkärikäynnit ja sairauspoissaolot ovat suuri ekonominen taakka yhteiskunnalle. Kliinisten näytteiden diagnostiikkaan käytetään herkkää ja luotettavaa PCR-testiä, eikä rinovirusten diagnostiikkaan ole tällä hetkellä käytössä vieritestiratkaisuja. Jotta kliinisistä näytteistä voidaan testata mahdollisen virusgenomin läsnäolo, on niistä ensin eristettävä RNA jollakin nukleiinihappojen puhdistusmenetelmällä. Tämän insinöörityön kokeellinen osuus toteutettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa. Työn tavoitteena oli pystyttää yrityksessä kehitetty uusi näytteenkäsittelymenetelmä rinovirukselle. Kehitettävä näytteenkäsittelymenetelmä pohjautuu paramagneettisten silikananopartikkeleiden käyttöön nukleiinihappojen puhdistuksessa. Näytteenkäsittelymenetelmä oli tarkoitus optimoida mahdollisimman tehokkaaksi RNA-saannon suhteen sekä yhteensopivaksi Orion Diagnostica Oy:n isotermaalisen geenimonistusmenetelmän, SIBA®:n (Strand Invasion Based Amplification), kanssa. Näytteenkäsittelymenetelmän kehittämiseen käytettiin pääasiallisena tutkimustyökaluna kvantitatiivista käänteiskopiointi-PCR-protokollaa. Näytteenkäsittelymenetelmän parametreja optimoitiin siten, että eristyksen RNA-saanto oli kvantitatiivisten tulosten perusteella konsentraatioltaan mahdollisimman suuri. Lopuksi kehitettävän näytteenkäsittelymenetelmän RNA-saantoa verrattiin vertailumenetelmällä saavutettuun RNA-saantoon vastaavasta rinoviruspartikkelimäärästä. RNA:n puhdistaminen rinoviruspartikkeleista onnistui kehitettävällä menetelmällä hyvin: vertailumenetelmän tehokkuudesta jäätiin parhaimmillaan vain 9,4 % jälkeen. Menetelmän todellista tehokkuutta RNA-saannon suhteen ei kuitenkaan voitu määrittää, sillä käytettävissä ei ollut kliinisiä rinoviruspositiivisia näytteitä tai kliinistä virusmäärää vastaavaa tunnettua viruspartikkelipitoisuutta. Jatkossa näytteenkäsittelymenetelmää kehitettäessä on kiinnitettävä huomiota etenkin sen soveltuvuuteen käytettäväksi oikean näytematriisin sekä SIBA®-teknologian ja kylmäkuivattujen reagenssien kanssa.Human rhinoviruses are the most common cause of respiratory tract infections throughout the year. Medical visits and missed days at work due to respiratory illnesses caused by rhinoviruses are economic burdens for society. Rhinoviruses in clinical respiratory samples are commonly detected by a sensitive and reliable PCR test. Currently there are no point-of-care tests available for the diagnosis of human rhinoviruses. In order to detect possible presence of rhinovirus, the RNA has to be first extracted from clinical samples by a nucleic acid purification method. The experimental part of this thesis was executed in the research and development laboratory of Orion Diagnostica Oy. The aim was to set up a novel sample preparation method for rhinovirus, previously developed within the company. The sample preparation method is based on the use of paramagnetic silica coated nanoparticles in nucleic acid purification. The goal was to optimize the method regarding the extracted RNA yield and compatibility with the Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) – an isothermal gene amplification technology owned by Orion Diagnostica Oy. A quantitative reverse transcription polymerase chain reaction protocol was used as a tool to measure the functionality of the sample preparation method. Parameters of the sample preparation method were optimized to achieve a maximal RNA yield and level of purification. Finally, the RNA yield of the developed method was compared to that of a reference method from the same virion count. RNA purification of rhinovirus particles using the developed method was successful: at its best the method missed only 9.4 percentages of the efficiency rate of the reference method. The efficiency rate for clinical samples could not yet be determined due to lack of samples or a known viral load. In the future, the sample preparation method should be developed further together with actual sample matrix, SIBA® technology and freeze-dried reagents for SIBA reaction